Фармакопея | pharmacopeia.ru | Том 1

Метод 6

(Флуорометрический метод с о-фталальдегидом)

Метод основан на дериватизации белка

-фталальдегидом, который

реагирует с первичными аминогруппами белка (N-концевая аминокислота и
ε-аминогруппа остатков лизина) с последующим измерением флуоресценции
полученного  комплекса.  Чувствительность  количественного  определения
может  быть  увеличена  гидролизом  белка  перед  добавлением

фталальдегида. Гидролиз делает α-аминогруппу, входящую в структуру
аминокислот, доступной для взаимодействия с фталальдегидным реактивом.
Метод является высокочувствительным и требует небольшого количества
белка.

Определению мешают буферные растворы, содержащие первичные

амины, такие как трис(гидроксиметил)аминометан, и аминокислоты, которые
взаимодействуют с

-фталальдегидом. Аммиак в больших концентрациях

также взаимодействует с

-фталальдегидом. Флуоресценция, полученная при

взаимодействии аминов с

-фталальдегидом, может быть нестабильной.

Использование автоматизированных методик для стандартизации данного
метода позволяет повысить точность и воспроизводимость определения.

Стандартные растворы.

Растворяют соответствующий стандартный

образец белка в 0,9 % растворе натрия хлорида. Части полученного раствора
разводят  0,9  %  раствором  натрия  хлорида  для  получения  не  менее  пяти
стандартных растворов  с  концентрациями  в  интервале  от  10  мкг/мл до 200
мкг/мл.  Доводят  значение  рН  раствора  до  8,0  -  10,5  перед  добавлением
фталальдегидного реактива.

Испытуемый раствор

. Готовят раствор испытуемого лекарственного

средства  в  0,9  %  растворе  натрия  хлорида  с  концентрацией  белка,
находящейся  в  пределах  интервала  концентраций  стандартных  растворов.
Доводят  значение  рН  раствора  до  8,0-10,5  перед  добавлением
фталальдегидного реактива.

Контрольный раствор.

Используют 0,9 % раствор натрия хлорида.