Фармакопея | pharmacopeia.ru | Том 2

документации.

Для оценки эффективности амплификации следует использовать

положительные и отрицательные стандартные и/или контрольные образцы,
указанные в фармакопейной статье и нормативной документации или в
инструкции по применению набора реагентов.

ПЦР осуществляют в автоматическом режиме на специальных

программируемых приборах – амплификаторах, контролирующих заданные
параметры реакции: температуру и длительность отдельных этапов цикла
(денатурация, гибридизация и синтез цепи ДНК), число циклов и т.д.

Денатурация.

Выдерживание при температуре от 94 до 96 °С в течение

установленного времени; при этом двойная цепь денатурируется
(расплетается) с образованием двух одноцепочечных молекул ДНК.

Гибридизация (отжиг).

При температуре 45 – 65 °С в течение

установленного времени происходит гибридизация праймеров и
одноцепочечной ДНК-матрицы, в процессе которого праймеры распознают
комплементарные им участки матричной ДНК.

Синтез цепи ДНК (элонгация).

При температуре 65

−

72 °С в течение

установленного  времени  происходит  репликация  (достраивание)  одной  из
одноцепочечных  ДНК  от  точки  связывания  праймера  «вправо»  (для  одной
цепи  ДНК)  и  «влево»  (для  другой  цепи  ДНК).  В  результате  вновь
синтезируемые  молекулы  ДНК  становятся,  в  свою  очередь,  матрицей  для
аналогичного синтеза новых копий.

Продолжительность цикла составляет 0,5 - 5 мин. Сразу после

окончания первого цикла процедура повторяется и происходит
экспоненциальное

увеличение содержания фрагментов ДНК. Обычно ПЦР

состоит из 25

−

40 циклов. В каждом цикле происходит удвоение числа копий

амплифицируемого участка ДНК, приводящее к увеличению в
геометрической прогрессии общего содержания продуктов реакции.

Эффективность ПЦР и количество синтезированного при этом

заданного фрагмента ДНК зависит от многих факторов, среди которых