(рис. 2). Отрезок на оси абсцисс, соответствующий скорости, равной
половине максимальной, будет представлять собой
К
м
. При проведении
ферментативной реакции реакционная смесь должна содержать такое
количество субстрата, которое обеспечит насыщение фермента в течение
всего хода определения (количество субстрата, взятого для проведения
ферментативной реакции, должно быть примерно на 30% выше насыщающей
концентрации).
Если форма кривой зависимости начальной скорости реакции (
υ
o
) от
начальной концентрации субстрата ([
S
]
0
) отличается от гиперболической,
определение параметров по уравнению Михаэлиса–Ментен невозможно.
Такие отклонения наблюдаются в случае ингибирования или активации
фермента субстратом, а также при работе с аллостерическими ферментами. В
этом случае оптимальной является та концентрация субстрата, при которой
начальная скорость реакции максимальна ([
S
]
опт
)– точка перегиба на
экспериментальной кривой зависимости начальной скорости реакции от
начальной концентрации субстрата (рис. 2).
После выбора насыщающей концентрации субстрата необходимо
проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [
P
] от
t
.
В качестве субстратов используются как природные вещества, такие
как альбумин, казеин, крахмал, так и синтетические. Природные субстраты
ферментов используют большей частью для подтверждения подлинности.
Синтетические субстраты обеспечивают более высокую точность и лучшую
воспроизводимость при количественном определении ферментативной
активности.
3. Концентрация фермента
([
Е
]
0
).
В соответствии с уравнением
Михаэлиса–Ментен начальная скорость ферментативной реакции (
υ
o
) в
подавляющем большинстве случаев линейно зависит от концентрации
фермента ([
E
]
0
). Выбор оптимальной для каждого метода концентрации
Предыдущая < | 1329 | > Следующая | Главная | pharma-14@mail.ru | pharmacopeia.ru | Скачать в PDF