background image

контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве «стоп 
реагента» применяют серную кислоту. 

Прямой неконкурентный метод ИФА

 

Методика прямого ИФА имеет лишь небольшие отличия от методики 

непрямого  неконкурентного  ИФА.  Так,  I  и  II  стадии  одинаковы  в  обоих 
типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте ИФА на 
стадии  III  используют  специфические  исследуемому  антигену  антитела, 
конъюгированные  с  ферментной  меткой,  и  они  прямо  взаимодействуют  с 
исследуемым  веществом.  При  необходимости  также  можно  проводить 
титрование  конъюгатов  аналогично  принципу,  описанному  ранее  для 
неконъюгированных антител. Стадия IV в рамках прямого неконкурентного 
ИФА не проводится. 

«Сэндвич»  метод ИФА 

 

В  данном  варианте  ИФА  используется  пара  антител  (первичные  и 

вторичные),  специфичных  к  пространственно  удаленным  эпитопам 
исследуемого антигена.  

I.  Сорбция  антител  на  твердой  фазе. 

Методика  сорбции  антигена 

аналогична  методике  сорбции  антител  в  разделе  «Косвенный 
неконкурентный метод ИФА». 

II.  Блокировка. 

Методика  блокировки  мест  неспецифического 

связывания  на  подложке  (твердой  фазе)  аналогична  методике  блокировки, 
описанной в разделе «Косвенный неконкурентный метод ИФА».  

III. Инкубация с антигеном. 

В лунки планшета с преадсорбированными 

антителами  вносят  по  50  мкл  исследуемого  вещества  и  стандартных 
разведений антигена, если нет других указаний в фармакопейной статье или 
нормативной  документации.  Разведения  антигена  должны  быть 
приготовлены  на  основе  фосфатно-солевого  буферного  раствора  (pH  9,0), 
содержащего  0,1  %  твин-20,  поскольку  твин-20  снижает  неспецифическое 
связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И 

Предыдущая <  | 3022  | > Следующая  | Главная  | pharma-14@mail.ru |  pharmacopeia.ru | Скачать в PDF