background image

При  элюировании  рекомендуется  низкая  скорость  изменения  состава. 

Градиент  оптимизируют,  добиваясь  четкого  разделения  между  всеми 
реперными  пиками,  выбранными  в  качестве  «маркерных»  пиков  для 
проводимого испытания. 

Детектирование 

Наиболее распространенным детектором при пептидном картировании 

является спектрофотометрический детектор, с определением поглощения при 
аналитической  длине  волны  в  интервале  от  200 нм  до  280  нм  (обычно  214 
(215)  нм,  могут  использоваться  так  же  длины  волн  210,  256  нм).  Для 
повышения  информативности,  используются  также  флуориметрический  и 
масс-спектрометрический детекторы.  

Другие параметры.  

Для  достижения хорошей  воспроизводимости,  как  правило,  требуется 

контроль температуры колонки, которая варьируется в широких пределах от 
25  до  60 

0

С.  Скорость  подвижной  фазы  составляет  от  0,1  мл/мин  до  2,0 

мл/мин. 

РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК 
Целью  валидированного  метода  характеристики  протеина  методом 

пептидного  картирования  является  определение  как  минимум  95  % 
теоретического состава структуры белка. 

Использование  стандартного  образца  параллельно  с  испытуемым 

пептидом  является  необходимым  условием  при  разработке  и  валидации 
методик пептидного картирования. 

Разработка методики. 

В ходе разработки методики пептидного картирования осуществляется 

подбор  условий  подготовки  белка  к  гидролизу  и  описываются 
последовательности  аминокислот  для  каждого  пептидного  фрагмента, 
получаемого в результате гидролиза.  

Установление  первичной  структуры  пептидных  фрагментов 

(последовательности  аминокислот),  образованных  в  ходе  гидролиза 

3044