Фармакопея | pharmacopeia.ru | Том 2

2.1.

Приготовление раствора прекалликреина из плазмы крови доноров.

Приготовление буфера А.

6,055 г трис(гидроксиметил) аминометана, 1,17 г натрия хлорида, 50 мг

гексадиметрин бромида и 10 мг натрия азида помещают в мерную колбу

вместимостью 1000 мл, растворяют в воде очищенной, доводят рН до 7,95-

8,05 2 М раствором кислоты хлористоводородной, перемешивают, доводят

объем раствора водой до метки и вновь перемешивают. Раствор хранят при

температуре от 2 до 8 ºС не более 6 мес.

Аликвоту плазмы крови доноров диализуют против 10 объемов буфера

А в течение 20 час. Отдиализованную плазму наносят на колонку ДЭАЭ-

агарозы, уравновешенную буфером А, объем которой в 2 раза превышает

объем плазмы. Проводят элюцию буфером А со скоростью 20 мл/см

/час.

Собирают фракции первого пика, поглощающие при 280 нм. Полученный

пул контролируют на отсутствие активности калликреина: аликвоту пула

смешивают с предварительно подогретым рабочим раствором хромогенного

субстрата в соотношении 1:20, инкубируют при 37 ºС в течение 2 мин и

определяют изменение оптической плотности в минуту (∆А/мин) при длине

волны 405 нм. Полученный пул прекалликреина пригоден, если ∆А/мин не

превышает 0,001. К собранной фракции добавляют натрия хлорид из расчета

7 г/л, фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм, разделяют на

аликвоты и хранят при температуре ниже минус 25 ºС в течение 12 мес.

Аликвоту после размораживания используют в течение рабочего дня.

2.2.

Приготовление раствора прекалликреина из готового реагента

прекалликреина проводят в соответствии с указаниями в инструкции по

применению реагента, если иное не указано в нормативной документации.

Приготовление рабочего раствора синтетического хромогенного

субстрата. 25 мг хромогенного субстрата (например, S-2302, H-D-пролил-L-

фенилаланил-L-аргинина-p-нитроанилин дигидрохлорид) растворяют в

буферном растворе до получения раствора с необходимой концентрацией в

соответствии с указаниями в нормативной документации.

Подготовка испытуемого образца. Испытуемый препарат

иммуноглобулина человека разводят буферным раствором до содержания

белка 30 г/л. Необходимость разведения испытуемого препарата альбумина

человека указывают в нормативной документации с учетом данных по

валидации методики на основании предполагаемого содержания АПК и

выбранного диапазона значений калибровочной кривой.

Подготовка СО. Подготовку СО осуществляют в соответствии с

прилагаемой инструкцией по применению к СО. Готовят ряд разведений СО

с использованием буферного раствора. Разведения и кратность их

приготовления

выбирают

таким

образом,

чтобы

зависимость

регистрируемой скорости реакции (или оптической плотности) от

концентрации АПК имела линейный характер.