Предколоночная дериватизация с о-фталевым альдегидом

каждой  аминокислоты,  кроме  цистеина,  находится  в  области  от  40  до
320 фмоль.  Предел обнаружения для цистеина составляет около 800 фмоль.
Линейность  сигнала  наблюдается  в  области  2,5  –  500 мкмоль  с
коэффициентом корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных
результатов  рекомендуется  использовать  для  гидролиза  образцы
белка/пептида массой более 30 нг.

МЕТОД 5. Предколоночная дериватизация с о-фталевым альдегидом
(ОФА)

ОФА в присутствии тиольных соединений реагирует с первичной

аминогруппой, образуя  производные  изоиндола с  сильной флуоресценцией.
Метод  не  позволяет  определять  вторичные  аминокислоты  (иминокислоты,
например,  пролин).  В  качестве  тиольных  соединений  могут  быть
использованы 2-меркаптоэтанол и 3-меркаптопропионовая кислота. ОФА не
обладает флуоресценцией и, следовательно, не образует мешающих пиков на
хроматограмме.  Кроме  того,  его  растворимость  и  стабильность  в  водном
растворе,  наряду  с  высокой  скоростью  реакции,  позволяют  проводить
автоматическую  дериватизацию  с  использованием  программируемого
автоматического  инжектора  (автосэмплера)  для  смешивания  испытуемого
образца  и  реагента (-ов).  Основным  недостатком  ОФА  является  его
неспособность  реагировать  с  вторичными  аминокислотами  (например,
пролином).  Компенсировать  данный  недостаток  можно  сочетанием  с
методиками, описанными в методах 7 или 8.

За предколоночной дериватизацией аминокислот с ОФА следует

дальнейшее разделение смеси ОФА-производных аминокислот методом
обращенно-фазовой

ВЭЖХ

последующим

флуориметрическим

детектированием. Так как ОФА-производные аминокислот неустойчивы,
анализ методом ВЭЖХ проводят сразу после дериватизации. Использование
программируемого

автоматического

инжектора

для

проведения

дериватизации позволяет производить ввод проб в хроматограф строго через