Фармакопея | pharmacopeia.ru | Том 2

Оценивают полноту переноса белков визуально по переносу

окрашенных маркеров молекулярных масс, все основные белковые полосы
которого должны быть выявлены на мембране.

Детекция
Для детекции результатов метода вестерн-блот проводят обработку

(гибридизацию) исследуемого препарата антителами. Для этого мембрану с
перенесенными  на  нее  белками  помещают  в  контейнер  с  блокирующим
буферным раствором и инкубируют на орбитальном шейкере в течение 30 –
60  мин  (если  не  предусмотрено  иное  в  фармакопейной  статье  или
нормативной документации) для предотвращения неспецифической сорбции
антител на мембране.

После этого промывают мембрану в буферном растворе для отмывки

трижды по 5 мин, если не указано иное в фармакопейной статье или
нормативной документации.

Затем мембрану обрабатывают раствором первых антител к

анализируемому  белку,  приготовленным  с  использованием  буферного
раствора для антител (если нет других указаний в фармакопейной статье или
нормативной  документации)  непосредственно  перед  использованием  в
соответствии  с  инструкцией  по  применению.  Обработку  антителами
проводят при комнатной температуре в течение 30 – 60 мин (если нет других
указаний в фармакопейной статье или нормативной документации).

Далее трижды по 5 мин проводят отмывку мембраны буферным

раствором от несвязавшихся антител на орбитальном шейкере при комнатной
температуре, если нет других указаний в фармакопейной статье или
нормативной документации.

После отмывки мембраны, проводят обработку (гибридизацию)

раствором  вторых  антител.  В  качестве  вторых  антител  используют
поликлональные  антитела  к  иммуноглобулинам  того  вида  животного,
которое  использовалось  для  получения  первых  антител.  Данные  антитела
конъюгированы  с  ферментом  (пероксидаза  из  корней  хрена  или  щелочная