Раствор для карбоксиметилирования

Восстанавливающий раствор

. Готовят смесь, состоящую из 1 объема

исходного раствора А и 3 объемов исходного раствора В (буферный раствор,
содержащий 6 М гуанидина гидрохлорида и 0,25 М ТРИС-гидрохлорида).

Методика

. Около 10 мкг испытуемого образца растворяют в 50 мкл

восстанавливающего  раствора  и  прибавляют  около  2,5 мкл  исходного
раствора  С.  Выдерживают  в  течение  2 ч  при  комнатной  температуре  в
защищенном от света месте в атмосфере азота или аргона. Для проведения
реакции пиридинэтилирования к раствору белка прибавляют около 2 мкл 4-
винилпиридина  и  выдерживают  дополнительно  2 ч  при  комнатной
температуре  в  защищенном  от  света  месте.  Обессоливают  белок/пептид
методом  ОФ-ВЭЖХ,  собирая  белковую/пептидную  фракцию.  Перед
кислотным  гидролизом  собранный  образец  может  быть  высушен  при
помощи вакуумного центрифугирования.

МЕТОД 9

Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при
карбоксиметилировании в жидкой фазе.

Исходные растворы

. Готовят, как указано в Методе 8.

Раствор для карбоксиметилирования

. Готовят 100 г/л раствор

йодацетамида в 96 % спирте.

Буферный

раствор

Используют

восстанавливающий

раствор,

приготовленный, как указано в Методе 8.

Методика

. Испытуемый образец растворяют в 50 мкл буферного раствора и

прибавляют около 2,5 мкл исходного раствора С. Выдерживают в течение 2 ч
при комнатной температуре в защищенном от света месте в атмосфере азота
или аргона. Прибавляют раствор для карбоксиметилирования в 1,5-кратном
избытке  по  отношению  к  теоретическому  общему  содержанию  тиолов,  и
выдерживают дополнительно в течение 30 мин при комнатной температуре в
защищенном  от  света  месте.  Если  содержание  тиолов  в  белке  неизвестно,
прибавляют  5 мкл  0,1 М  раствора  йодацетамида  из  расчета  на  каждые