background image

документации. 

Для  оценки  эффективности  амплификации  следует  использовать 

положительные  и  отрицательные  стандартные  и/или  контрольные  образцы, 
указанные  в  фармакопейной  статье  и  нормативной  документации  или  в 
инструкции по применению набора реагентов. 

ПЦР  осуществляют  в  автоматическом  режиме  на  специальных 

программируемых  приборах  –  амплификаторах,  контролирующих  заданные 
параметры  реакции:  температуру  и  длительность  отдельных  этапов  цикла 
(денатурация, гибридизация и синтез цепи ДНК), число циклов и т.д. 

Денатурация. 

Выдерживание при температуре от 94 до 96 °С в течение 

установленного  времени;  при  этом  двойная  цепь  денатурируется 
(расплетается) с образованием двух одноцепочечных молекул ДНК. 

Гибридизация  (отжиг).

  При  температуре  45  –  65  °С  в  течение 

установленного  времени  происходит  гибридизация  праймеров  и 
одноцепочечной  ДНК-матрицы,  в  процессе  которого  праймеры  распознают 
комплементарные им участки матричной ДНК. 

Синтез цепи ДНК (элонгация).

 При температуре 65 

 72 °С в течение 

установленного  времени  происходит  репликация  (достраивание)  одной  из 
одноцепочечных  ДНК  от  точки  связывания  праймера  «вправо»  (для  одной 
цепи  ДНК)  и  «влево»  (для  другой  цепи  ДНК).  В  результате  вновь 
синтезируемые  молекулы  ДНК  становятся,  в  свою  очередь,  матрицей  для 
аналогичного синтеза новых копий. 

Продолжительность  цикла  составляет  0,5  -  5  мин.  Сразу  после 

окончания  первого  цикла  процедура  повторяется  и  происходит 
экспоненциальное

 

увеличение  содержания  фрагментов  ДНК.  Обычно  ПЦР 

состоит из 25

40 циклов. В каждом цикле происходит удвоение числа копий 

амплифицируемого  участка  ДНК,  приводящее  к  увеличению  в 
геометрической прогрессии общего содержания продуктов реакции. 

Эффективность  ПЦР  и  количество  синтезированного  при  этом 

заданного  фрагмента  ДНК  зависит  от  многих  факторов,  среди  которых 

2903