следует выделить: тип и термопроводящие характеристики амплификатора,
тип используемой ДНК-полимеразы, состав буферного раствора, объем
реакционной смеси; длину и первичную структуру праймеров; выбранную
специфическую последовательность ДНК.
Используемое оборудование и режим амплификации указывают в
фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на
инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР.
Детекция продуктов амплификации
Электрофоретическое
разделение
.
Продукты
амплификации
анализируют с помощью различных методов электофореза в агарозном или
полиакриламидном гелях. Для визуализации ДНК используют окрашивание
интеркалирующим красителем (обычно - бромистым этидием, дающим
характерное красноватое свечение при исследовании в проходящем
ультрафиолетовом свете), серебра нитратом или используют мечение
различными флюорохромами, дающими флюоресценцию определенной
длины волны при возбуждении лазерным лучом. Для оценки размеров
амплифицированных фрагментов используют маркеры и стандартные
образцы.
Концентрацию геля, приготовление растворов, маркеры, стандартные
образцы и условия электрофореза указывают в фармакопейной статье или
нормативной документации.
Детекция флюоресценции в режиме реального времени.
Способ
детекции
амплифицированного
фрагмента
с
использованием
флюоресцентных меток возможен при проведении ПЦР в реальном времени
(Real Time PCR). Отличительной чертой данного метода, в сравнении с
классической ПЦР, является возможность не только качественного (по
конечной точке или в режиме «реального времени»), но и количественного
определения ДНК/РНК в исследуемом материале, отсутствие стадии
электрофореза и автоматическая регистрация детектируемого сигнала.
Метод основан на измерении флуоресцентного сигнала в каждом цикле
Предыдущая < | 2904 | > Следующая | Главная | pharma-14@mail.ru | pharmacopeia.ru | Скачать в PDF
>